1.范圍2.規(guī)范性引用文件3.術(shù)語和定義4.實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)建設(shè)5.生物安全6.實(shí)驗(yàn)室布局7.儀器設(shè)備8.人員9.標(biāo)識(shí)10.文件、記錄與檔案

本文件規(guī)定了畜禽養(yǎng)殖場細(xì)菌耐藥性水平評(píng)價(jià)的設(shè)備和材料、樣品采集、菌株分離與藥物敏感性試驗(yàn)、評(píng)價(jià)對(duì)象、評(píng)價(jià)方法、記錄和生物安全的要求

本文件適用于豬、雞、鴨等畜禽養(yǎng)殖場的大腸埃希菌和腸球菌（屎腸球菌或糞腸球菌）耐藥性水平評(píng)價(jià)

本文件規(guī)定了紙片擴(kuò)散法檢測畜禽源細(xì)菌耐藥性的方法

本文件適用于從畜禽及其產(chǎn)品中分離的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌耐藥性的紙片擴(kuò)散法檢測

本文件規(guī)定了畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測的設(shè)備和材料、試劑和培養(yǎng)基、樣品采集與保存、細(xì)菌分離鑒定與保存、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)、生物安全的要求

本文件適用于畜禽源的大腸埃希氏菌、腸球菌和彎曲桿菌分離鑒定，及其抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（微量肉湯稀釋法）

本指南規(guī)定了細(xì)菌生物被膜培養(yǎng)、觀測和耐藥性評(píng)測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件要求、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施與驗(yàn)證等技術(shù)要求本指南適用于研究機(jī)構(gòu)、教育機(jī)構(gòu)以及其他生物技術(shù)相關(guān)機(jī)構(gòu)或公司內(nèi)需培養(yǎng)、觀測細(xì)菌生物被膜，并檢測細(xì)菌生物被膜耐藥性的實(shí)驗(yàn)操作人員閱讀并參考使用本指南亦適用于臨床和食源性分離細(xì)菌菌株生物被膜形成能力的鑒定、臨床和食源性分離菌株生物被膜耐藥性的測定、細(xì)菌生物被膜形成和耐藥分子機(jī)制的探究、細(xì)菌生物被膜防控方法及藥物的研發(fā)等領(lǐng)域本指南可作為實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌生物被膜培養(yǎng)與構(gòu)建、觀測與定量、以及耐藥性評(píng)估等工作的技術(shù)依據(jù)根據(jù)《中華人民共和國專利法》，對(duì)于本指南中所涉及專利技術(shù)（US9988380B2，US10416153B2，ZL201711231930.8，CN110974838A）的使用，需獲得專利權(quán)所有人書面許可細(xì)菌生物被膜培養(yǎng)方法與技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)以下生物被膜培養(yǎng)方法與技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)均以銅綠假單胞菌為模式菌株撰寫，其他菌種培養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)條件可按需求適當(dāng)調(diào)整

銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）是一種常見的革蘭氏陰性條件致病菌，在正常人皮膚、呼吸道、腸道以及多種自然環(huán)境如水、土壤中廣泛分布

此菌為桿狀單鞭毛形態(tài)，適宜生長溫度為25-37℃，在42℃也可生長，于LB培養(yǎng)基上呈青綠色圓形菌落且極易附著在不同基質(zhì)表面形成生物被膜

銅綠假單胞菌是醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌之一，可在免疫力低下的患者不同部位形成生物被膜引起長期慢性感染，包括燒傷傷口感染、呼吸道感染和尿路感染等，并可引發(fā)菌血癥和敗血癥等致命并發(fā)癥

此菌對(duì)多種抗生素耐藥，并且耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，包括形成生物被膜、加強(qiáng)外排泵系統(tǒng)、改變細(xì)胞膜通透性與藥物作用靶點(diǎn)、以及分泌抗菌酶等

銅綠假單胞菌生物被膜的形成機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜，例如通過過量分泌胞外多糖、積累胞外DNA、降低運(yùn)動(dòng)能力、調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)等

作為研究生物被膜的模式菌株，銅綠假單胞菌早已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建生物被膜、檢測其耐藥性并開發(fā)用藥方案的研究中，是以本指南以銅綠假單胞菌為模式菌株撰寫，其他菌種的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)條件可按需適當(dāng)調(diào)整以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)本指南囊括四種常用的體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法，包括孔板培養(yǎng)法、玻璃珠培養(yǎng)法、玻片培養(yǎng)法和Peg-lid培養(yǎng)法

（1）孔板培養(yǎng)法（4.1.1）將稀釋菌液在96孔板或24孔板中培養(yǎng)，生物被膜附著于孔壁上，移除懸浮液并洗脫浮游菌體可得到生物被膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)

孔板培養(yǎng)法一般用于檢測菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等實(shí)驗(yàn)

此培養(yǎng)法可與多種染色法結(jié)合用于定量生物被膜，培養(yǎng)出的生物被膜結(jié)構(gòu)可用不同顯微鏡觀察

此培養(yǎng)法具有通量高、培養(yǎng)時(shí)間短和操作簡單等優(yōu)勢，但培養(yǎng)的生物被膜厚度與硬度較低，浮游菌體不易洗脫造成平行間差異較大

（2）玻璃珠培養(yǎng)法（4.1.2）在24孔板中將玻璃珠置于稀釋菌液內(nèi)培養(yǎng)，生物被膜附著于玻璃珠表面，洗脫浮游菌體可得到生物被膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)

此培養(yǎng)法與孔板培養(yǎng)法類似，一般用于檢測菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等試驗(yàn)

此培養(yǎng)法可與多種染色法結(jié)合用于定量生物被膜，但不易在顯微鏡下觀察

此培養(yǎng)法具有通量高、培養(yǎng)時(shí)間短等優(yōu)勢，但操作略復(fù)雜

此方法培養(yǎng)的生物被膜厚度與硬度較高，浮游菌體較易清洗，平行間差異較小

（3）玻片培養(yǎng)法（4.1.3）將玻片插入菌液培養(yǎng)，生物被膜附著于玻片表面，去除撥片并洗脫浮游菌體得到生物被膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)

此方法一般用于檢測菌種生物被膜形成能力、觀察生物被膜結(jié)構(gòu)與形態(tài)，可與多種染色方法和多種顯微鏡結(jié)合使用觀測生物被膜構(gòu)態(tài)

此方法通量高、培養(yǎng)時(shí)間短，但操作略復(fù)雜

此方法培養(yǎng)的生物被膜量較大、厚度與硬度高，浮游菌體易清洗，平行間差異較小

（4）Peg-lid培養(yǎng)法（4.1.4）將帶有凸起楔子（peg）的96孔板蓋置于裝有菌液的96孔板中培養(yǎng)，生物被膜附著于peg中下端，取下蓋子并洗脫peg上的浮游菌體可得到生物被膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)

此方法與孔板培養(yǎng)法類似，一般用于檢測菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等試驗(yàn)

此培養(yǎng)法可與多種染色法結(jié)合用于定量生物被膜，但培養(yǎng)出的生物被膜由于在楔子頂端，不易于顯微鏡觀察

此培養(yǎng)法具有通量高、培養(yǎng)時(shí)間短和操作簡單等優(yōu)勢，培養(yǎng)的生物被膜厚度與硬度較高，浮游菌體較易洗脫、平行間差異較小

每種培養(yǎng)與觀測方法細(xì)節(jié)請見下文

4.1.1孔板培養(yǎng)法適用范圍：孔板生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場景：（1）需要檢測不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測不同菌株在生物被膜狀態(tài)下對(duì)藥物的敏感/耐受性

針對(duì)孔板培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節(jié)5.1.2a）、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度（章節(jié)6.1）

以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：圖1.體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（孔板培養(yǎng)法）4.1.1.1實(shí)驗(yàn)材料：a.無菌96孔板（或24孔板,Nest/Corning）；b.無菌儲(chǔ)液器；c.100μL排槍移液器（或1mL移液器）；d.15mL無菌搖菌管；e.100μL（或1mL）移液器槍頭；f.LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；g.所需菌株；h.廢液桶；i.75%酒精；j.無菌ddH2O；k.無菌生理鹽水

4.1.1.2培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】首先將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜

在無菌操作臺(tái)中，用新鮮培養(yǎng)基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液傾倒入無菌儲(chǔ)液器，再用排槍移液器將稀釋菌液加入96孔板或24孔板孔洞中，并置于所需溫度下靜置培養(yǎng)生物被膜

實(shí)驗(yàn)菌種和對(duì)照菌種均按照附錄Xa的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xa），隨后對(duì)生物被膜進(jìn)行分析（章節(jié)5）

4.1.1.3技術(shù)要點(diǎn)a.所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染；b.在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用排槍反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差；c.孔板培養(yǎng)生物被膜需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)；d.移除廢液以及清洗生物被膜時(shí)須注意不可用槍頭觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性

4.1.2玻璃珠培養(yǎng)法適用范圍：玻璃珠生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場景：（1）用于循環(huán)培養(yǎng)生物被膜進(jìn)行壓力條件進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，（2）需要檢測不同菌株在生物被膜狀態(tài)下對(duì)藥物的敏感/耐受性

針對(duì)玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要為：CFU計(jì)數(shù)法（章節(jié)5.3.2b）

以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：圖2.體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（玻璃珠培養(yǎng)法）4.1.2.1實(shí)驗(yàn)材料：a.無菌24孔板；b.無菌儲(chǔ)液器；c.1mL移液器d.15mL無菌搖菌管；e.1mL移液器槍頭；f.LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；g.無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；h.所需菌株；i.廢液桶；j.75%酒精；k.鑷子；l.3-5mm玻璃珠

4.1.2.2培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】首先將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用新鮮培養(yǎng)基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉(zhuǎn)移至24孔板孔洞中，并加入兩顆無菌玻璃珠，37℃100rpm轉(zhuǎn)速搖晃培養(yǎng)過夜

實(shí)驗(yàn)菌種和對(duì)照菌種均按照附錄Xa的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xb），隨后對(duì)生物被膜進(jìn)行分析（章節(jié)5）

4.1.2.3技術(shù)要點(diǎn)a.所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染；b.在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用移液器反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差；c.孔洞內(nèi)菌液不可過多，以免搖晃培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成交叉污染；d.用無菌鑷子轉(zhuǎn)移玻璃珠時(shí)，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性；e.孔板培養(yǎng)生物被膜需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)

4.1.3玻片培養(yǎng)法適用范圍：玻片生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場景：（1）需要檢測不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測不同菌株在生物被膜狀態(tài)下對(duì)藥物的敏感/耐受性

針對(duì)玻片培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節(jié)5.1.2c）和生物被膜耐藥性（章節(jié)5.3.2c）

以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：圖3.體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（玻片培養(yǎng)法）4.1.3.1實(shí)驗(yàn)材料：a.無菌培養(yǎng)皿（靜置培養(yǎng)需準(zhǔn)備6孔板）；b.15mL無菌搖菌管；c.LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；d.無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）e.所需菌株；f.廢液桶；g.75%酒精；h.鑷子；i.載玻片

4.1.3.2培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】首先將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用新鮮培養(yǎng)基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，并加入無菌載玻片，37℃100rpm轉(zhuǎn)速搖晃培養(yǎng)過夜

實(shí)驗(yàn)菌種和對(duì)照菌種均按照附錄Xa的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xc），隨后對(duì)生物被膜進(jìn)行分析（章節(jié)5）

4.1.3.3技術(shù)要點(diǎn)a.所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染；b.培養(yǎng)皿內(nèi)菌液不可過多，以免搖晃培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成污染；c.用無菌鑷子轉(zhuǎn)移載玻片時(shí)，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性；d.搖晃培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封培養(yǎng)皿防止液體蒸發(fā)

4.1.4Peg-lid培養(yǎng)法適用范圍：Peg-lid生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場景：（1）需要檢測不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測不同菌株在生物被膜狀態(tài)下對(duì)藥物的敏感/耐受性

針對(duì)Peg-lid培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節(jié)5.1.2c）和生物被膜耐藥性（章節(jié)5.3.2c）

以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：圖4.體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（peglid培養(yǎng)法）4.1.4.1實(shí)驗(yàn)材料：a.96孔板；b.Peglid蓋子（見附錄圖三）;c.無菌儲(chǔ)液器；d.100μL排槍移液器；e.15mL無菌搖菌管；f.100μL（或1mL）移液器槍頭；g.LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；h.所需菌株；i.廢液桶；j.75%酒精；k.無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；l.無菌生理鹽水

4.1.4.2培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】首先將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用新鮮培養(yǎng)基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉(zhuǎn)移至96孔板中，再將peglid小心蓋入菌液中

37℃100rpm轉(zhuǎn)速搖晃培養(yǎng)過夜

實(shí)驗(yàn)菌種和對(duì)照菌種均按照附錄Xa的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xd），隨后對(duì)生物被膜進(jìn)行分析（章節(jié)5）

4.1.4.3技術(shù)要點(diǎn)a.所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染；b.在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用排槍反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差；c.孔洞內(nèi)菌液不可過多，以免置入peglid或震蕩培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成污染；d.需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)；e.移除廢液以及清洗生物被膜時(shí)須注意不可觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性

4.2體外動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)本指南囊括兩種常用的體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法，包括管式培養(yǎng)法和池式培養(yǎng)法，詳細(xì)介紹如下：（1）管式培養(yǎng)法將菌液注入硅膠管內(nèi)靜置附著后，將培養(yǎng)基以勻速注入硅膠管，流動(dòng)培養(yǎng)生物被膜，生物被膜附著于管壁上

此方法一般應(yīng)用于對(duì)生物被膜樣品需求量大的實(shí)驗(yàn)，如生物被膜樣品收集，胞外多糖收集生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）等

此方法可形成大量生物被膜，生物被膜結(jié)構(gòu)厚，通量較高，但培養(yǎng)時(shí)間較長，操作較復(fù)雜，并不易用顯微鏡觀察生物被膜結(jié)構(gòu)

（2）池式培養(yǎng)法將菌液注入培養(yǎng)池通道內(nèi)，翻轉(zhuǎn)靜置待細(xì)菌附著與蓋子上之后，將培養(yǎng)基以勻速注入培養(yǎng)通道，流動(dòng)培養(yǎng)生物被膜，生物被膜附著于三通道池蓋上

此方法一般應(yīng)用于生物被膜形態(tài)觀察、藥物對(duì)生物被膜形態(tài)的影響等實(shí)驗(yàn)，此方法形成生物被膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)完整，可結(jié)合有熒光標(biāo)記的菌株或不同染色法，直接在顯微鏡下觀測生物被膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)，但通量較低，操作復(fù)雜，培養(yǎng)時(shí)間較長

4.2.1管式培養(yǎng)法（tubing-biofilm）適用范圍：管式生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場景：（1）需要模擬管道內(nèi)生物被膜生長環(huán)境的研究，（2）需要相對(duì)大量生物被膜樣品的研究，（3）生物被膜對(duì)藥物/化合物代謝（biotransformation）的相關(guān)研究等

針對(duì)管式培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：干重/濕重分析（章節(jié)5.4）、基因組/轉(zhuǎn)錄組/蛋白組提取和測序分析、電子顯微鏡觀察（章節(jié)5.7）、氧氣探針/化合物探針監(jiān)測等

以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：管式生物被膜培養(yǎng)法具有較高通量，可以一次性培養(yǎng)多通道生物被膜樣品；該方法能夠一次性產(chǎn)出大量生物被膜樣品，常用于干重/濕重分析、基因樣本提取，EPS等代謝產(chǎn)物提取、電子顯微鏡觀察和氧氣探針/化學(xué)探針觀察等

圖5.體外動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（管式培養(yǎng)法）4.2.1.1實(shí)驗(yàn)材料：a.15mL無菌搖菌管；b.長50cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管（潤澤）；c.長2520cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管（潤澤）；d.長15cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管（潤澤）；e.長10cm，內(nèi)直徑3.2mm硅膠管（潤澤）；f.長30cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管（潤澤）；g.等徑直通接頭（潤澤）；h.變徑直通接頭（潤澤）；i.魯爾接頭（潤澤）；j.2個(gè)2L玻璃培養(yǎng)瓶；k.10%LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；l.過濾器（過濾孔0.22μm）；m.蠕動(dòng)泵（aperistalticpump，MasterFlex）；n.所需菌株；o.醫(yī)用尖銳物處理容器；p.75%酒精；q.鑷子；r.5mL及1mL無菌針管；s.無菌針頭；t.移液器；u.無菌移液管

4.2.1.2培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】首先將裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、硅膠管、除泡器和鑷子在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將硅膠管、除泡器和鑷子干燥備用

如圖一所示，在無菌操作臺(tái)中按順序用安裝雙向接頭的硅膠管b連接裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、無阻泵、過濾器、硅膠管c、d、e、f，2L廢液罐，同個(gè)裝置內(nèi)至少三個(gè)平行（圖內(nèi)展示一個(gè)平行），將整個(gè)系統(tǒng)置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)

將目標(biāo)菌株接種至適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm搖晃培養(yǎng)過夜

在無菌操作臺(tái)中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.1，用無菌針管吸入2mL稀釋菌液，并將稀釋菌液分別注入硅膠管b平行裝置中，用硅膠封口后靜置培養(yǎng)2小時(shí)使細(xì)菌細(xì)胞粘附于管壁,用10%LB流動(dòng)培養(yǎng)基培養(yǎng)3至7天，建立生物被膜

首先將生物被膜管式培養(yǎng)裝置進(jìn)行滅菌和組裝，在用藥組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入工作濃度的目標(biāo)抗生素并混合均勻；在陽性對(duì)照組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜濃度的粘菌素colistin并混合均勻；在陰性對(duì)照組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入等體積的用藥組抗生素的溶劑并混合均勻

用藥組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組均按照附錄X的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xe），后收集生物被膜進(jìn)行觀察

4.2.1.3技術(shù)要點(diǎn)a.所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染;b.使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員；c.將使用過的針管與針頭丟棄入醫(yī)用尖銳物處理容器統(tǒng)一處理，避免誤傷操作人員；d.保證無阻泵運(yùn)行速度一致，避免液體回流造成污染；e.保證硅膠管管壁厚度適宜，造成管壁破裂，影響生物被膜形成；f.在培養(yǎng)過程中如需添加培養(yǎng)基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染；g.培養(yǎng)瓶口須用透氣封口膜密封防止培養(yǎng)基蒸發(fā)

4.2.2池式培養(yǎng)法（flow-cellbiofilm）適用范圍：池式生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場景：（1）需要實(shí)時(shí)觀察生物被膜形態(tài)的相關(guān)研究，（2）需要實(shí)時(shí)觀察生物被膜中標(biāo)記蛋白/基因表達(dá)及分布的相關(guān)研究，（3）需要實(shí)時(shí)觀察生物被膜群落中不同菌種相對(duì)位置關(guān)系的研究等

針對(duì)池式培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：死活菌細(xì)胞染色法（章節(jié)5.2）、激光共聚焦熒光顯微鏡觀測法（章節(jié)5.6）、3D熒光成像定性定量法（章節(jié)5.5）等

以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：池式生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場景：（1）圖6.體外動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（池式培養(yǎng)法）4.2.2.1　實(shí)驗(yàn)材料：a.15mL無菌搖菌管；b.三通道培養(yǎng)池（3-channelflow-cell）與樹脂蓋；c.蓋玻片；d.硅膠膠水;e.長50cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管；f.長25cm長20cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管，雙端安裝；g.長15cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管；h.長30cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管；i.等徑直通接頭；j.魯爾接頭；k.2個(gè)2L玻璃培養(yǎng)瓶；l.10%LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；m.過濾器（過濾孔0.22μm）；n.蠕動(dòng)泵（aperistalticpump）；o.所需菌株；p.醫(yī)用尖銳物處理容器；q.75%酒精；r.鑷子；s.5mL及1mL無菌針管；t.無菌針頭；u.移液器；v.無菌移液管

4.2.2.2培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】首先將生物被膜池式培養(yǎng)裝置進(jìn)行滅菌和組裝，在用藥組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入工作濃度的目標(biāo)抗生素并混合均勻；在陽性對(duì)照組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜濃度的粘菌素colistin并混合均勻；在陰性對(duì)照組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入等體積的用藥組抗生素的溶劑并混合均勻

用藥組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組均按照附錄X的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xf），后收集生物被膜進(jìn)行觀察

4.2.2.3技術(shù)要點(diǎn)a.所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染;b.使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員；c.將使用過的針管與針頭丟棄入醫(yī)用尖銳物處理容器統(tǒng)一處理，避免誤傷操作人員；d.保證無阻泵運(yùn)行速度一致，避免液體回流造成污染；e.保證培養(yǎng)池翻轉(zhuǎn)狀態(tài)，以免影響生物被膜形成；f.黏結(jié)培養(yǎng)池與池蓋時(shí)須小心不可將池蓋壓破，并須保證培養(yǎng)池與池蓋完全密封，避免菌液與培養(yǎng)基溢出造成污染；g.保證培養(yǎng)池所有通道暢通，避免堵塞造成液體回流與污染；h.在培養(yǎng)過程中如需添加培養(yǎng)基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染；i.培養(yǎng)瓶口須用透氣封口膜密封防止培養(yǎng)基蒸發(fā)

地方標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)動(dòng)物病原菌藥敏試驗(yàn)和耐藥性檢測技術(shù)規(guī)范》，主管部門為安徽省市場監(jiān)督管理局。

地方標(biāo)準(zhǔn)《畜禽養(yǎng)殖過程細(xì)菌耐藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》，主管部門為上海市市場監(jiān)督管理局。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌耐藥性調(diào)查規(guī)范 通則》，主管部門為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部。本文件界定了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌耐藥性調(diào)查規(guī)范的術(shù)語和定義，確立了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌耐藥性調(diào)查流程，規(guī)定了細(xì)菌耐藥性調(diào)查中樣品采集、信息采集、細(xì)菌分離鑒定、菌株保存、藥物敏感性試驗(yàn)、結(jié)果判定和結(jié)果記錄與統(tǒng)計(jì)的要求，描述了上述各步驟相應(yīng)追溯或證實(shí)的方法。本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌對(duì)漁用抗菌藥物的耐藥性調(diào)查。本文件界定了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌耐藥性調(diào)查規(guī)范的術(shù)語和定義，確立了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌耐藥性調(diào)查流程，規(guī)定了細(xì)菌耐藥性調(diào)查中樣品采集、信息采集、細(xì)菌分離鑒定、菌株保存、藥物敏感性試驗(yàn)、結(jié)果判定和結(jié)果記錄與統(tǒng)計(jì)的要求，描述了上述各步驟相應(yīng)追溯或證實(shí)的方法。本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌對(duì)漁用抗菌藥物的耐藥性調(diào)查。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測樣品采集技術(shù)規(guī)程》，主管部門為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部。本文件規(guī)定了動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測樣品的采集、保存和運(yùn)輸?shù)脑瓌t、要求和操作方法。本文件適用于動(dòng)物直腸/泄殖腔拭子、咽/喉拭子、鼻拭子、糞便、腸道內(nèi)容物、生鮮乳、其他病料等樣品的采集、保存和運(yùn)輸。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測定 紙片擴(kuò)散法》由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)歸口上報(bào)，主管部門為國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的紙片擴(kuò)散檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物及其制品中分離的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌耐藥性的檢測，其他動(dòng)物源性細(xì)菌的耐藥性測定可參考使用本標(biāo)準(zhǔn)。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測定 紙片擴(kuò)散法》由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)歸口上報(bào)，主管部門為國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的紙片擴(kuò)散檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物及其制品中分離的大腸埃希氏菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌耐藥性的檢測，其他動(dòng)物源性細(xì)菌的耐藥性測定可參考執(zhí)行本方法。